ATP 生物发光技术在微生物检测中的应用

ATP 生物发光技术在微生物检测中的应用

尹子波1，侯玉柱1，2，尹建军1，2，*，宋全厚1，2

（1．中国食品发酵工业研究院，北京100027；2．国家食品质量监督检验中心，北京100027）

摘要：ATP（三磷酸腺苷）生物发光法作为一种不断完善成熟的微生物快速检测方法，具有简便、快速、高灵敏度等优点。对该方法的历史发展、检测原理、目标物提取方法、应用领域和*新研究成果等做重点介绍，并对ATP 生物发光法的应用现状和发展方向进行总结和展望。

关键词：ATP 生物发光法；荧光素—荧光素酶；**磁分离技术（IMS）；生物**纳米磁微粒（BMNPs）

     微生物污染严重威胁着人类的身体健康与生命**，目前国际上检测微生物的标准方法是营养琼脂平板计数法（PCA），但PCA 法需37 ℃下培养48 h，操作繁琐，不能做到快速检测。现在国内外开始广泛的研究与应用各种微生物快速检测技术，如**学方法（ELISA[1-2）] 、电阻抗测量法[3]、快速纸片法[4]、核酸法[5]、微菌落技术[6]等。ATP 生物发光法具有简便、快速、灵敏度高的优点，适合对微生物污染进行实时监控，符合食

品加工企业的需求。目前，国内外对该方法进行了大量的研究与应用。ATP 生物发光技术在微生物检测中的应用

1 ATP 生物发光法的发展历史、原理及检测步骤

1.1 ATP 生物发光法的发展历史

ATP 的生物发光机理*早在1949 年由McEIroy和Strehler 提出[7]。1983 年，James D. Moyer 和J. FrankHenderson[8]提出细胞内源性ATP的含量可以反映细胞的活性和活细胞的数量。1985 年，de Wet，J . R 等[9]**克隆了北美荧火虫（P. Pyralis） 的萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）基因，并在大肠杆菌（E.coli）中表达，从中得到具有活性的虫荧光素酶。该酶分子量为62 ku，与荧光素反应能够产生波长为560 nm 的荧光。20 世

纪80 年代，英国人首先研制出ATP 检测仪，随后发展到欧洲、美国和日本。2002 年，我国卫生部颁发了食品加工企业HACCP （Hazard Analysis and Critical Control Point）实施指南，鼓励食品企业引入ATP 生物发光快速检测系统。目前，在餐饮服务食品**现场快速检测设备配备基本标准中，ATP 生物发光快速检测系统被应用于环境洁净度的评估检测。

1.2 生物发光法的原理

ATP 生物发光法的原理就是在荧光素酶E（luciferase）和Mg2＋的作用下，荧光素LH2 （ luciferin）与ATP发生腺苷酰化被活化，活化后的荧光素与荧光素酶相结合，形成了荧光素—AMP 复合体，并放出焦磷酸（PPi）。该复合体被分子氧氧化，形成激发态复合物P*-E·AMP，放出CO2，当该复合物从激发态回到基态时发射光。并*终形成氧化虫荧光素P 和AMP[10]。反应过程如下：

E+LH2+ATP E·LH2-AMP+PPi （1）

E·LH2-AMP+O2 [P*-E·AMP]+CO2 （2）

E-P+hv+AMP （3）

经过实验表明，荧光素酶为非典型的Michaelis-Menten 氏酶[11]，*适pH 为7.5，对其作用底物之一—ATP 的酶促动力学曲线呈S 型。在适当低的ATP 浓度范围内，其反应的速度与ATP 浓度成**反应的关系，即检测的荧光值强度与ATP 浓度成一定比例关系。对于一定生理时期内的活体微生物，均有较恒定水平ATP 含量，使得ATP 浓度与活体微生物含量之间

有较好的线性关系。而且微生物死亡后，其体内的ATP 会很快被胞内酶所降解，不会对活体微生物的测定产生影响。ATP 这些特点，使ATP 生物发光法成为较好的活体微生物的检测方法。

1.3 检测步骤

ATP 生物发光法检测微生物的一般步骤：预先制作样品微生物含量与ATP 生物发光值标准曲线，然后取样、提取ATP、加入酶反应试剂、测定样品微生物ATP发光值、*后根据标准曲线推算出样品中微生物实际数值。

2 ATP 生物发光法优缺点

ATP 生物发光法检测的优点主要是快速、简便、灵敏度高。从20 世纪80 年代以来，该方法的检测限由10-14 mol 提高到了10-18 mol[12]，每次检测微生物ATP的时间可以控制在几分钟之内，是目前检测微生物数目*快捷的方法。其缺点是不能区分微生物与非微生物ATP，不能特异性地区分微生物的种类，并且样品本身和ATP提取剂等含有的某些离子会对ATP的测定造成干扰和抑制发光作用，其灵敏度仍不能满足某些样品的直接检测要求，如饮用水中菌落总数不能超过100 cfu/mL，而目前直接检测限为1 000 cfu/mL[13]。

3 微生物ATP 提取方法的研究

ATP 生物发光法的关键步骤是如何提取胞内ATP。目前，针对ATP 提取方法的研究有很多，主要有加热裂解、超声、酸、有机提取剂方法等。考虑到提取方法的简便与实用性，ATP 提取剂是*为常用的一种方法，对于一种好的提取剂而言，首先要保证能够快速提取细菌ATP 并且不会降解细菌ATP，其次对后续的ATP 检测系统干扰*小或无干扰。舒柏华，赵志耀等[14]过对超声、加热超声、加热、三***（TCA）、氯仿等5 种萃取方法进行的比较，结果显示：超声加热方法*佳, 加热法次之。它们对微生物ATP 分析抑制较小，且ATP 萃取率高，但需附加设备，操作繁琐，难于推广。伍季、朱海华等[15]研究了季胺盐类表面活性剂提取细菌ATP 方法，并将该法与传统TCA 方法的提取效果做了比较，他们选择了几种裂解效果较好的表面活性剂苯扎氯铵（BAC）、苯扎溴铵（BAB）、双癸基二甲基溴化铵（DDAB）、双十烷基二甲基氯化铵（DDAC）、十二烷基硫酸钠（SDS）等作为ATP 提取剂的主要成分进行了实验研究，优化提取条件，并将传统的TCA 法与这些方法的ATP 提取效果进行了对比。实验结果表明，采用苯扎氯铵提取细菌ATP 优于TCA 和其他表面活性剂方法。然而，提取剂中的表面活性剂或多或少都会干扰荧光素—荧光素酶系统，造成微生物ATP 检测值的降低，从而降低灵敏度。Lundin. Arne 和Anson. John George[16]研究采用惰性中和剂与ATP 提取剂相结合的方法，从而有效降低或消除提取剂对酶活性的抑制作用。该方法操作简单、迅速。其原理主要是利用环糊精的特殊结构—6～8 个葡萄糖分子组成环形结构，内部疏水基团可与表面活性剂的疏水尾部牢固结合，外部亲水基团对酶活性无抑制作用，从而达到使表面活性剂与酶分离的目的，降低或消除表面活性剂对酶活性的抑制作用。Nae-Cherng Yang 和Wai－Meng，Ho[17]等比较了高氯酸（HClO4）、硼酸缓冲液加热、去离子水（DW）加热等提取方法对细胞ATP 检测的影响。实验表明，HClO4、磷酸缓冲盐（PBS）、三羟甲基硼酸缓冲液（Trisborate

buffer）、一种溶菌缓冲液（lysis buffer）均对发光值有较大的抑制作用，而DW（煮沸的去离子水）法发光值*高，能使ATP 水解酶变性失活，同时对细胞ATP 有很好的提取效果。与其他方法相比有简单、迅速、高效的优点，如HClO4 方法需中和，PBS 方法需进一步的加热条件。但该方法仅局限于细胞ATP 的提取。

4 应用

4.1 在水中微生物检测领域的应用

由于水的基质比较简单，同时对酶的活性影响比较小，所以目前该方法检测水中微生物的应用*为广泛。吴慧清、李程思等[18]利用ATP 生物发光法检测饮用水中的微生物含量。他们采用微滤膜技术过滤富集水中的微生物，然后加入缓冲剂和发光剂检测荧光值，经过实验比较，孔径为0.22 μL 和0.45 μL 的膜截留细菌率相差不大，但0.45 μL 膜过滤速度远快于0.22 μL膜。因此建议采用0.45 μL 孔径的膜。该方法操作简单，成本低，检测结果能够成功反映出水中微生物总数。

4.2 在乳品工业生产中的应用

李春艳、霍贵成等[19]研究了ATP 生物发光法在生牛乳中微生物检测的应用，他们首先将生乳用PBS 缓冲液稀释20 倍，取50 μL 加入滴体细胞裂解剂混匀并过滤，然后膜上加入2 滴细菌裂解剂，再加入50 μL 酶反应试剂，用枪反复吹吸3 次后测荧光值。实验表明，

ATP 生物发光法检测结果与培养及平板计数法结果之间有良好的线性关系（r=0.948 5），相关程度为显著相关（p<0.001）。

4.3 在肉类微生物检测中的应用

舒伯华、孙丹陵等[20]研究了ATP 生物发光法在肉类食品中微生物检测的应用，实验结果表明，生肉类食品由于体细胞ATP 对结果的干扰较大，因此需要**掉样品中体细胞ATP，其采用的方法是首先用0.2 %的TritonX-100 和0.15 %的apyrase 混合液**体细胞ATP，然后加入3 %的三***混合并振摇1 min，离心后取上清检测ATP，该光值即为细菌ATP 发光值，整个过程需15 min。而熟肉类中非细菌ATP 含量低，对结果影响较小可以省略**体细胞ATP 步骤而直接测定，整个过程需4 min。经过38 份样品实验对比，ATP 生物发光法检测结果与细菌菌落平板计数方法之间具有良好的线性关系（r=0.98）。

4.4 在物体表面微生物检测中的应用

曹利蓉、张伟等[21]研究了ATP 生物发光法在餐具表面微生物污染检测方面的应用，他们首先在选定测试区域内，滴加2 滴ATP 释放液，用无菌棉拭子均匀涂抹测试样品，采样面积为100 cm2；然后在棉拭子头部滴加6 滴ATP 释放液，提取ATP；*后立即将拭子头部ATP 提取液点在检测膜上，用ATP 荧光仪测定生物发光值（RLU），同时采用国标法检测大肠菌群和细

菌总数。其中规定大肠菌群阳性为不合格，细菌总数以大于500 cfu/100 cm2 为不合格，ATP 生物发光法以RLU 大于600 为不合格。在282 份样品中，3 种检验方法所测出不合格样本的阳性率分别为23.4 ％，25.5 ％，9.4 ％。ATP 生物发光法的阳性率与大肠菌群和细菌总数的阳性率没有显著性差异（P＞0．05）。

4.5 在啤酒中的应用

伍季、王燕等[22]研究了ATP 生物发光法快速检测啤酒中的微生物技术。他们采用0.45 μL 滤膜真空过滤1 L 啤酒，将过滤后的滤膜置于无菌的试管中，然后加入250 μL 0.2 mol/L Tris—乙酸和250 μL ATP 抽提剂，抽提60 s，抽提完成后，取100 μL 溶液与100 μL

荧光素—荧光素酶溶液混合均匀，检测发光值。实验结果表明，啤酒中菌落总数与生物发光值之间有显著的相关性（R2=0.998 5）。经过实际啤酒样品的检测，利用ATP生物发光法判断啤酒是否合格的结果与平板计数法判定结果一致。

4.6 在面粉中的应用

李利霞、伍金娥等[23]优化了ATP 生物发光法，并快速检测面粉中的微生物总数。在所优化的方法中，D-荧光素浓度为70 mg /L，荧光素酶浓度为50 mg /L，Mg2+浓度为0. 25 mmol/L。用无菌生理盐水将面粉稀释后，分别用ATP 生物发光法和传统平板培养法计菌落总数，两者结果无显著性差异，同时该法还具有良好的重现性（RSD＝4．0 ％）。实验证明ATP 生物发光法可以方便快捷、准确稳定的检测出面粉中微生物总数。

4.7 与**分离技术结合的应用

目前，国内外研究较多的是**磁分离技术与ATP 生物发光技术（IMS/ATP）两者结合检测水中微生物的方法。其主要原理是采用目标菌抗体包被的磁珠从样品中将目标细菌分离，然后洗脱并富集目标细菌，*后采用ATP 生物发光技术检测菌含量。该方法*初由Lee 和Deininger[24]应用到检测水中的大肠杆菌含量。随后Bushon 等[25]将该方法做适当的改进，采用多克隆抗体技术并用来检测水中的大肠杆菌和粪肠球菌。该方法既特异性检测了目标菌，又对其进行了浓缩，提高了检测限。Rebecca N. Bushon 等[26]采用该方法检测了

废水中大肠杆菌和粪肠球菌的含量，实验结果表明，IMS/ATP 方法结果与传统的平板培养结果具有较好的线性关系。Yuxiao Cheng 和Yajun Liu 等[27]在此基础上研究了生物**纳米磁微粒BMNPs （直径约为20 nm）技术。该方法关键步骤是构建合适的纳米**磁微粒，

他们首先将抗生物素蛋白结合并覆盖到纳米磁微粒表面起到架桥的作用，然后再将生物素标记的抗体结合到抗生物素蛋白上构成BMNPs。与其他方法相比，该方法具有更强的抗原抗体作用力、更多的抗原抗体识别位点。因此，该方法可以结合更多的目标微生物。结果表明，在低浓度情况下，BMNPs 可以结合≥90 %的大肠杆菌，而普通大小的磁珠颗粒仅能结合大约50%的目标菌。同时该方法的*低检测限为20 cfu/mL，作用时间为1 h，要远优于其它方法。如噬菌体荧光技术（FBA）[28] 在原奶中大肠杆菌检测限为10 cfu/mL~100 cfu/mL，且需10 h 的富集培养时间。流式抗体检测器技术[29]的大肠杆菌检测限为1.7×105 cfu/mL，需时间30 min。酶联**磁分离—化学发光法[30]的大肠杆菌检测限为1×105 cfu/mL~1×106 cfu/mL，需时间1.5 h。

5 结论与展望

ATP 生物发光法具有快速、简单方便、灵敏度高的特点，与其它的微生物快速检测方法相比有着巨大优势，目前在食品加工行业中正不断推广应用。但该方法存在着容易受到外界因素的干扰，不能定性鉴别微生物种类，对于某些样品的直接检测灵敏度仍然达不到要求的缺点。因此，选取合适的ATP 提取剂，降低外界因素的干扰，增强对微生物的特异性识别，提高检

测灵敏度成为改善和研究该方法的关键点。目前，新型的ATP 提取剂的研制已经取得了巨大的进步。同时，将其它新技术与ATP 生物发光法结合成为一种潮流，例如**磁分离与ATP 生物发光技术（IMS/ATP）。IMS/ATP 技术既降低了外界因素的干扰，对微生物也具有特异性识别能力，同时又极大提高了检测灵敏度。但IMS/ATP 技术也有成本较高，设备相对较复杂的缺点。相信在不久的未来，随着科技的不断发展，ATP生物发光法检测微生物的技术一定会更加成熟和完善，*终将应用到更加广泛的领域。

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