ＰＣＲ及其改进技术在食品微生物检测中的应用
柳洪芳１，宋 慧２
（１．黑龙江省农垦科学院测试化验中心，黑龙江佳木斯１５４００７；２．吉林农业大学生命科学学院）
摘要：简述了ＰＣＲ及其几种改进技术，并对其在食品微生物检测中的应用进行综述。
关键词：ＰＣＲ改进技术；食品微生物；检测
民以食为天，食以安为先。食品**是关系到人体健康和国计民生的重大问题。食品中的微生物是人类许多**发生的根源之一，随着人们对食品**性认识的不断提高，传统的微生物检测方法因检测成本高、速度慢、效率低等问题，难以满足现代社会快速检测的要求。而ＰＣＲ及其改进技术以其特异性强、快速准确和灵敏度高等优点在食品微生物检测领域得到广泛的应用。
１ 常规ＰＣＲ技术及其在食品微生物检测中的应用
多聚酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．ＰＣＲ）是１９８５年美国的ＫＡＲＹ ＭＵＬＬＩＳ等人创建的一种在体外快速扩增特定基因或ＤＮＡ序列的方法，也称基因的体外扩增法，其扩增过程包括以下３个步骤：①变性，即将模板双链ＤＮＡ序列置于９５℃高温下，使其变性解链成两个单链模板。②退火，低温（５０～６５℃）时，使人工合成的两个引物与单链ＤＮＡ模板特异性地互补结合。③延伸，在适宜的温度（７２℃）下，ＤＮＡ 聚合酶以单链ＤＮＡ 为模板，沿５，→３方向掺入核苷酸，使引物延伸合成模板的互补链，这就是新合成的ＤＮＡ双链。新合成的ＤＮＡ双链又可作为扩增的模板，继续重复以上的ＤＮＡ多聚酶链反应程序，就使得ＤＮＡ 片断得到有效的扩增。
ＰＣＲ技术具有快速、灵敏、操作方便等优点，早在１９９２年ＮＡＫＡ ＪＩＭＡ Ｈ［１］利用ＰＣＲ方法对病原菌进行检测，而利用ＰＣＲ技术检测食品中病原微生物到近些年来才比较广泛应用。刘胜贵［２］等人利用ＰＣＲ技术检测猪肉中沙门氏菌，对已知和未知被沙门氏菌污染的猪肉的培养物均能准确检测。对不同稀释度的样品进行ＰＣＲ扩增，当ＤＮＡ含量只有０．０１ｐｇ时，还能扩增出条带，说明该方法检测猪肉中沙门氏菌具有特异性高且灵敏、快速等特点。巢国祥［３］等人通过ＰＣＲ法扩增ｈｌｙ基因建立快速检
测单核细胞增生性李斯特氏菌（Ｌｍ）的方法。并检测模拟污染生猪肉、水和牛奶，检测限达１０ｃｆｕ／２５ｇ（ｍＬ）。该方法对Ｌｍ的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点，可用于食品的Ｌｍ的分离检测。
２ ＰＣＲ改进技术在食品微生物检测中的应用
随着生物技术的飞速发展和各项新技术与ＰＣＲ技术的有机结合，衍生出一些ＰＣＲ改进技术。主要介绍实时荧光定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ＩＭＳ－ＰＣＲ、ＤＧＧＥ－ＰＣＲ等４种ＰＣＲ改进技术及其在食品微生物检测中的应用。
２．１ 实时荧光定量ＰＣＲ技术及其在食品微生物检测中的应用
实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＦｌｕｒｅｓｃｅｎｔＱｕａｎｔｉｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）技术，是指在ＰＣＲ反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个ＰＣＲ进程，*后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。此技术于１９９６年由美国Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司推出，该技术实现了ＰＣＲ 从定性到定量的飞跃，除了具有常规ＰＣＲ的快速、灵敏、操作方便等特点外，还具有以下优点：全封闭反应，无需凝胶电泳等ＰＣＲ后处理，减小对环境的污染；不使用有毒试剂，操作**；定量准确；仪器在线实时监测，结果直观。该技术的诸多优点使之在食品微生物的检测中的应用越来越广泛。李光伟［４］等针对沙门氏菌ｆｉｍＹ 基因，设计特异引物和探针，建立了检测食品中沙门菌的ＲＴＱ－ＰＣＲ方法。其检测灵敏度为１８０ｃｆｕ／ｍＬ，与国标法检出的阳性样本数基本保持一致，准确率达９９．７％。高虹［５］等建立了奶粉中阪崎肠杆菌ＲＴＱ－ＰＣＲ检测方法。其所建立的方法特异性强，灵敏度高，在２．２～５．４ｃｆｕ／ｌ００ｇ范围内线性关系良好；与ＦＤＡ方法比对实验表明，两种方法的检测结果完全一致。翁文川［６］等人针对单增李斯特氏菌溶血素基因（ｈＩｙＡ），设计特异的引物ＴａｇＭａｎ探针，优化体系，建立了食品中单核细胞增生李斯特氏菌的荧光定量ＰＣＲ检测方法，该方法检测低限为１ｃｆｕ／ｇ，整个流程只需２７ｈ。与传统方法进行对比，结果一致。Ｌｋｅｄａ［７］等根据金黄色葡萄球菌的ｓｅａ和ｎｕｃ基因设计引物，建立了脱脂奶粉中金黄色葡萄球菌的ＲＴＱ－ＰＣＲ检测方法。
２．２ 多重ＰＣＲ技术及其在食品微生物检测中的应用
多重ＰＣＲ是通过对普通ＰＣＲ技术的改进而建立起来的一种技术，是将多条引物和多条模板混合在一个反应体系中分别特异扩增不同的目的条带，或者多条引物和单一的模板ＤＮＡ混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片断，常用于对超长片断的扩增。与常规的ＰＣＲ相比，还具有扩增效率高、产物特异性高和经济简便等特点，特别适合食品中多种致病菌的快速检测。梁会营［８］等根据阪崎肠杆菌外膜蛋白Ａ（ｏｍｐＡ）基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（ｎｕｃ）基因序列，设计两对特异性引物，并优化了ＰＣＲ的条件，建立了婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重ＰＣＲ检测方法。结果表明，该方法具有很高的特异性，混菌检测灵敏度达到１０３ｃｆｕ／ｍＬ，为快速检测奶粉中病原菌提供了有效手段。陈伟［９］等对金黄葡萄球菌的ｎｕｃ基因、单增李斯特菌的ｈｌｖ基因和蜡样芽孢杆菌的ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ基因设计了引物，建立了３种致病菌的多重ＰＣＲ检测体系，结果显示该方法检测结果与单基因ＰＣＲ检测的灵敏度相同，结果稳定。整个检测过程在１６ｈ内完成，检测灵敏度可达ｌｃｆｕ／ｍＬ。王艳君［１０］等人针对沙门氏菌编码ＤＮＡ结合蛋白
的基因ｈｎｓ、大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７编码外膜蛋白紧密素的基因ｅａｅＡ 和单核细胞增生李斯特氏菌溶血素Ｏ基因Ｈｌｙ设计３对引物，建立同步检测肉制品中３种致病菌的多重ＰＣＲ方法。通过对多重ＰＣＲ特异性和灵敏度进行分析及对多重ＰＣＲ反应条件进行优化，结果表明，该方法简便、快速，可使混菌检测灵敏度达到１０３ｃｆｕ／ｍＬ。ＫＡＷＡＳＡＫＩＳ［１１］等人利用多重ＰＣＲ方法同时检测肉类中的沙门菌、李斯特菌和大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７，通过ＵＰＢ增菌培养基增菌后检测敏感性可达到１ｃｆｕ／２５ｇ。
２．３ ＩＭＳ－ＰＣＲ技术及其在食品微生物检测中的应用
**磁珠技术（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）是２０世纪７０年代中期发展起来的一项新的**学检测和分离技术。其原理是磁珠经过一定的处理后，可结合某种微生物特异性抗体，形成**磁珠。将这种带有特异性抗体的**磁珠加到待测样品中，相应的抗原物质就会和**磁珠上的抗体发生特异性结合，形成抗原－抗体－磁珠**复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，使复合物与其他物质分离，从而达到快速分离抗原物质的目的［１２］。该技术不仅具备了固相化试剂特有的优
点以及**学反应的高度特异性，还具有高效、快速、可重复性好、操作简单和不需昂贵的仪器设备等优点。现已在细胞分离和培养、生物大分子纯化、**学及微生物学检测等领域得到了广泛应用。该技术与ＰＣＲ结合，可大大缩短食品中致病菌检测时间，同时也增加了检测的特异性，克服ＰＣＲ检测中易出现假阳性的弱点。近年来，ＩＭＳＰＣＲ技术已应用于食品微生物的检测中。李敏［１３］等研究表明，将ＩＭＳ与多重ＰＣＲ结合，２４ｈ内即可检出食品中的单增李斯特菌，*低检测限可达１ｃｆｕ／２５ｇ（ｍＬ）。王晓闻［１４］等建立了沙门氏菌的磁捕获－ＰＣＲ检测方法，实验包括前增菌、**磁珠制备分离、ＤＮＡ提取及ＰＣＲ扩增，７ｈ即可完成检测过程，且检测灵敏度为９ｃｆｕ／ｍＬ。结果表明该方法操作简便、用时短、检出率高。翁文川［１５］等应用抗李氏菌**磁珠从增菌肉汤中筛选和富集目的菌。通过荧光ＰＣＲ技术检测李氏菌溶血素ｈｌｙＡ基因，建立了单增李斯特氏菌的**磁分离－荧光ＰＣＲ方法。该方法检测肉类制品中单增李斯特氏菌简便易行，可在２７ｈ内完成，特异性好，检测低限为１ｃｆｕ／ｇ。
２．４ ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术及其在食品微生物检测中的应用
ＰＣＲ－ＤＧＧＥ的技术是Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ等于１９８９年**提出的，将ＰＣＲ 和变性梯度凝胶电泳的（ＤＧＧＥ）分析技术结合起来是一种可将长度相同而序列不同的ＤＮＡ 片段混合物分离开的一项技术。ＤＧＧＥ的基本原理是：由于ＤＮＡ分子中４种碱基的组成和排列存在差异，造成不同序列的ＤＮＡ分子的解链温度不同，解链时所需的变性剂
的浓度也不同。当双链ＤＮＡ 分子在含梯度变性剂（尿素、甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，会致使序列不同的ＤＮＡ片段会在各自相应的变性剂浓度下变性，从而使ＤＮＡ分子的迁移速度不断下降，当产生的迁移阻力与电场力相对平衡时，不同序列的ＤＮＡ 片段滞留于凝胶的不同位置，形成相互分开的带谱。理论上只要选择的电泳条件足够精细，有一个碱基差异的ＤＮＡ长段都可以被分开。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术具有可检测不可培养类细菌、检测时间短、检测率高、重复性好等优点。近些年来，此技术在食品中检测微生物后应用也有报道。ＣＯＣＯＬＩＮ［１６］等建立一种直接检测食品中李斯特菌属的分子生物学方法。通过ＰＣＲ扩增李斯特菌和标准菌株的特异ｉａｐ基因，扩增产物再用ＤＧＧＥ进
行分离，鉴定出五种李斯特菌。李苗云［１７］等研究冷却猪肉贮藏过程中的微生物变化，直接提取不同冷藏天数肉样ＤＮＡ，对细菌１６ＳｒＤＮＡ的ｖ６－ｖ８区段进行ＰＣＲ 扩增，通过ＤＧＧＥ 及序列分析，结果表明，冷却猪肉耗氧贮藏过程中的微生物主要有：热杀索丝菌、莫拉氏菌、气单胞菌、假单胞菌、葡萄球菌和节杆菌，为快速检测冷却猪肉中的微生物污染提供新思路。
总之，由于ＰＣＲ及其改进技术可以快速特异地扩增任何期望的ＤＮＡ 片断和目的基因，使其在食品微生物检测领域已有着实际的应用。但在实际应用中也表现出一些缺陷，例如由于引物之间的抑制或引物和其它模板间的非特异性结合可能导致出现假阳性；实验条件不当可能导致产物产生突变；引物设计及靶序列选择不当可能降低灵敏度和特异性等。尽管还存在着一定的问题，相信随着ＰＣＲ及其改进技术的进一步发展和完善，ＰＣＲ及其改进技术在食品微生物检测领域会有更加广泛的应用，发挥更大的作用，必将把食品微生物检测技术带入一个新阶段。