深圳菲特立科技有限公司推出德国**微生物快速检测系统RVLM ,可快速定量的检测各类致病菌。详情请登陆www.szfitly.com 活菌总数;
大肠菌群;
大肠杆菌;
肠道杆菌科;
金黄色葡萄球菌;
绿脓杆菌;
沙门氏菌;
李斯特菌;
肠球菌;
亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌;
产气荚膜梭菌;
霉菌(曲霉属**、曲霉菌);
酵母菌。
中华人民共和国国家标准 GBT 7918.4-1987 化妆品微生物检测 绿脓杆菌
绿脓杆菌 在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。对人有致病力，常引起人皮肤化脓感染，特别是**、**、眼部**患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症，因此，在化妆品卫生标准中规定不得检出绿脓杆菌。
1 方法提要
根据本菌生物学特征:革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃条件下生长等，可与类似菌相区别。
2 培养墓和试剂
2.1 SCDLP液体培养基
见 GB 7 9 18.1- 87《化妆品微生物标准检验方法总则》。
2.2 十六烷**基澳化馁培养基
成分 : 牛肉膏3g
蛋 白陈 log
氯 化 钠 5g
十六 烷 三 甲 基 澳 化 按 0.3g
琼脂 20g
蒸馏 水 1000m1
制法 : 除 琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调PH为7.4- 7.6， 加入琼脂,115'C ( 101b)20min**后，制成平板备用。
2. 3 乙酞胺培养基
成分 : 乙酸胺10.Og
氯化 钠 5.0g
无水 磷 酸 氢 二 钾 1.39 g
无水 磷 酸 二 氢 钾 0.73 g
硫酸 镁 ( M gS O , · 7H , O ) 0.5g
酚 红 0.0 12g
琼脂 20g
蒸馏 水 1000m1
制法 :除 琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解，调PH为7.2,加入琼脂、酚红，121C(15lb)20 min高压**后，制成平板备用。
2. 4 绿脓菌色素测定用培养基
成分 : 蛋白陈20g
抓 化镁 1.4g
硫酸 钾 108
琼脂 18g
甘油 ( 化 学 纯 ) log
燕 馏 水 l000ml
制法 :将 蛋白陈、抓化镁和硫酸钾加到蒸馏水中.加温使溶解，调州至7.4.加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115'C (10 1b)20 min高压**后，制成斜面备用。
2. 5 明胶培养基
成分 : 牛肉膏39
蛋 白 陈 5g
明胶 120g
蒸 馏 水 1000ml
制法 :取 各成分加在燕馏水中浸泡20min,随时搅拌加温使溶解，调pH至7.4 ，分装于试管内，经115'C( 101b )20 m in**后，直立制成高层备用。
2.6 硝酸盐蛋白陈水培养基
成分 : 蛋白陈log
酵母 浸 青 3吕
硝 酸 钾 2g
亚硝 酸 钠 0.5g
燕 馏 水 loooml
制法 :将 蛋白陈和醉母浸膏加到蒸馏水中，加温使溶解，调pH为7.2,煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115'C( 101b )20 m in**后备用。
2.了 普通琼脂斜面培养基
成分 : 蛋白陈log
牛 肉 青 3g
抓 化 钠 5g
琼脂 15g
蒸馏 水 loooml
制法 :除 琼脂外，将其余成分溶解于燕馏水中，调叫为7.2-7.4，加入琼脂，加热溶解，分装试管，
121'C (15 1b) 15 min高压**后。制成斜面备用。
3 仪器
3. 1 培养箱:37'C .42 C。
3. 2 锥形烧瓶。
3. 3 试管。
3. 4 **平皿。
3. 5 **刻度吸管。
3. 6 显微镜。
3. 7 载玻片。
3. 8 接种针、接种环。
3. 9 电炉。
3. 10高压**锅。
4 操作步吸
4.1 增菌培养:取1:10样品稀释液lOm l加到90mlSCDLP液体培养基中，置37℃培养18-24h,如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
注:如无SCDLP液体培养基时，可用普通肉汤培养基。
植脸含防腐剂的化妆品时，在每1000.1普通肉汤中加1g卵磷脂 , 7g 吐温80。
4.2 分离培养:从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷**基澳化按琼脂平板上，置37℃培养18-24h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。在缺乏 十 六烷**基澳化按琼脂时也可用乙酞胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平皿中，放37℃培养24h，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不生长。
4.3 染色镜检:挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。
4.4 氧化酶试验:取一小块洁净的白色滤纸片放在**平皿内，用无菌玻瑞棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲荃对笨二胺试液，在15-30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴性.
4. 5 绿脓菌素试验:取可疑菌落2-3个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，置37'C培养24h，加入氯仿3-5ml，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于抓仿液内，待抓仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1N的盐酸1 ml左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。
4.6 硝酸盐还原产气试验:挑取被检的纯培养物，接种在硝酸盆膝水培养基中，置37℃培养24h，观察结果。凡在硝酸盐陈水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
4.7 明胶液化试验，取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置371C培养24h,取出放冰箱10^-30min，如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴性。
4.8 42℃生长试验:挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在41^-42℃培养箱中，培养24-48h，绿脓杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。
5 检验结果报告
被检 样 品 经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出有绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42 C生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中有绿脓杆菌。
附加说明:
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。
本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。
本标准主要起草人周淑玉。
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。